新药发现“难”已成为老生常谈的问题，并且随着创新药浪潮的发展，经常有人说：新药的低悬果实已经被摘完，现在剩下的都是难啃的骨头。如何打破这一禁锢？长久以来，传统高通量筛选一直是药物发现的重要工具，但是其弊端也显而易见。近年来，质谱技术的应用越来越广，正成为探索创新药的一种重要的研究手段。
5月17日，由银河集团186net推出的系列专题分享直播——银河集团186net医药观第三期已正式上线。银河集团186net质谱技术筛选平台副主任方芳博士做客本期直播间，围绕“质谱技术在新药发现中的应用”这一主题，系统地介绍了银河集团186net质谱技术，并列举多个代表性案例重点阐述了其对新药发现的助推作用。
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新药筛选的常用方法
在新药发现的初期高通量筛选发挥着重要的作用，为苗头化合物的发现提供技术基础。常用的新药筛选方法包括高通量筛选（HTS）、虚拟筛选、表面等离子共振技术（SPR）、DNA编码化合物库筛选（DEL）、质谱技术(共价，非共价)等。
方芳博士在此分别介绍了几种筛选方法的区别，她指出：“我们根据筛选的目的和成本等因素来选用合适的筛选方法。基于生物活性的HTS可筛选得到具有功能性的化合物，如果有成熟的方法可以参考，或者前期的药物开发没有那么困难，可以考虑这种筛选方法；虚拟筛选可以短时间内分析数量庞大的化合物，将实体筛选的化合物数量缩小，大大提高了实体筛选效率；SPR为基于亲和力的筛选，不仅可以得到结合信息，还可以获得动力学参数，从筛选的通用上考虑，更适合片段化合物库的筛选；DEL也是基于亲和力的筛选，用于筛选DNA编码的化合物库，筛选到有结合力的化合物需要重新合成，再进行下一步的验证。该方法蛋白耗量少，化合物数量可达百万-亿级别，如果时间和成本上比较充裕，可以考虑这种方法。”
提到质谱技术，方芳博士着重介绍了银河集团186netVe-Lead(Viva engine for Lead discovery)技术平台。她指出，银河集团186netVe-Lead技术平台不仅可提供质谱筛选，并且还提供覆盖药物早期研发的从靶标蛋白表达到药物化学优化的一站式服务。接着，方芳博士重点围绕3个质谱技术进行了具体阐述。
银河集团186netVe-Lead技术平台
亲和力质谱筛选（ASMS）
广泛的筛选形式及条件
ASMS技术发展于上世纪90年代中期，是传统高通量筛选技术的升级。其不依赖放射性、荧光标记或酶活性，化合物使用浓度低，方法开发简便，筛选通量高，适用于广泛的筛选形式及条件，可筛选传统方法不容易测定的靶标。
银河集团186net基于结构的药物发现平台，选择将超滤（UF-ASMS）、超速离心（UC-ASMS）和分子排阻色谱（SEC-ASMS）这3种技术相结合，通过银河集团186net独有的化合物库，设计出了一种快速、灵活、几乎能筛选所有可溶性蛋白靶标及化合物库的自主技术平台，实现筛选变构抑制剂，筛选正构位点抑制剂，筛选与不同构象的蛋白结合的化合物，筛选蛋白复合物或蛋白混合物等的目的。
三种不同质谱筛选技术
方芳博士以多个成功案例深入阐述了银河集团186net基于亲和力的质谱筛选。如银河集团186net基于ASMS筛选平台实现6个月从筛选到共晶，1年到先导化合物，3年到临床前候选化合物的记录。
ASMS筛选案例
另一个GPCR靶点案例中，她介绍道，银河集团186net通过ASMS筛选片段化合物库，再经过SPR验证得到其中一个苗头化合物的Kd值为12uM。
GPCR靶点ASMS筛选案例
此外，方芳博士还列举了目前比较热门的靶点的SEC-ASMS筛选案例，如膜蛋白靶点筛选、分子胶筛选 (molecular glue)、蛋白-RNA 及蛋白-DNA作用靶点、膜制备过表达蛋白、蛋白悬浮颗粒 (原纤维等聚合体)、变温度ASMS筛选（部分变性蛋白）、相分离筛选（生物分子凝聚体）等。
共价结合质谱筛选
药物开发的新兴手段
化合物的共价结合具有提高亲和力，延长与靶标的相互作用，改善选择性等特点。采用共价结合策略可使结合位置较浅的一些蛋白，也有可能找到合适的配体，进而发现苗头化合物。这引发了业内人士的关注，正成为新药研发的一种新兴手段。
Intact-MS（Intact protein mass spec，变性质谱）作为一种理想的筛选共价结合化合物库的方法，用于测试蛋白分子的精确分子量。当化合物与蛋白共价结合时，蛋白分子会出现相应分子量增加的情况。银河集团186net目前可基于客户提供的化合物库，提供Intact Mass筛选共价化合物服务。
方芳博士还介绍了共价结合质谱筛选流程，其主要分为化合物库的选择、化合物的制板、方法开发、小批量筛选或者全化合物库筛选、苗头化合物的验证、结合位点的鉴定及速率参数Kinact/KI检测等几个步骤。
共价结合质谱筛选流程
此外，她还分享了一个半胱氨酸靶点的片段化合物库筛选案例，进一步阐述了银河集团186net共价结合质谱筛选的应用。
半胱氨酸靶点筛选案例
苗头化合物的质谱验证
源头化合物的重要锁钥
在早期化合物筛选过程中，很多苗头化合物展现出来的“活性”仅仅是一种假阳性结果，其伪装成药物结合的样子，在各种筛选研究中大放烟雾弹，这为后续“hit to lead”的评估和改造带来了很大的障碍，需要研发人员进行多维度的验证，进一步筛选出真正的源头化合物。
方芳博士在此分享了银河集团186net质谱平台用于验证苗头化合物的几种质谱表征方法。
ASMS，除了筛选化合物库外，还可以用来检测靶点蛋白与感兴趣的化合物是否有结合，比如用其他方法测出来的苗头化合物，用ASMS进行交叉验证；测Kd值；做竞争实验，确定化合物与已知的配体是否有竞争还是有协同作用等。
Peptide mapping（肽图分析），通常用于共价化合物结合位点的鉴定，通过二级质谱检测经过酶解后的多肽，从而获得化合物与氨基酸的结合位点。
Native-MS（非变性质谱），相比于Intact-MS（变性质谱）的共价结合检测，还可以检测非共价结合，以及获得分子的结合比例。方芳博士在此列举了具体案例展示了Native-MS与Intact-MS的对比。
Native-MS与Intact-MS的对比案例
HDX-MS技术（氢氘交换质谱），是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术，用来分析配体共价结合和非共价结合的位点。其原理是将蛋白质浸入氘水溶液中，蛋白分子主链中的酰胺氢以不同的速率与溶液中的氘发生交换，这在一定程度上依赖于构型，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构相关信息，推测出不同位点的活性程度。最后，方芳博士表示，区别于肽图分析的结合位点，HDX-MS还可以分析反应基团周围的小分子与蛋白的作用，对结构新颖的、尚未有报道的蛋白质空间构想研究有重要意义。
银河集团186net质谱技术筛选平台
银河集团186net质谱技术筛选平台，拥有ASMS、Intact-MS、Native-MS、HDX-MS等多个先进的质谱技术，可提供基于质谱的药物筛选服务，包括片段化合物筛选、类药化合物库筛选及共价化合物库筛选，此外，也可提供各种质谱法鉴定化合物作用机理研究服务。同时，银河集团186net在药物靶标蛋白质制备、结构与功能研究领域拥有大量的经验和技术积累，拥有全球规模最大的蛋白结构研究平台，为基于质谱的药物筛选奠定了坚实的前期基础。
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