结构是功能的基础，不断丰富着人类对生命科学的认知。如何探索生物微观世界的奥秘？如何观察蛋白质、病毒和细胞在天然状态下的动态变化？冷冻电镜作为结构生物学领域强有力的工具，近年来取得了划时代的突破，从低分辨到近原子再到原子级别分辨率，持续拓宽丰富着结构生物学的边界。而这背后又发生了哪些故事？
银河集团186net冷冻电镜组项目经理李晓润博士做客第11期银河集团186net医药观，以“冷冻电镜技术—新医药时代复杂结构的破局者”为主题，深入浅出地讲解了冷冻电镜单颗粒分析技术（SPA）的发展及其在药物发现领域的实际应用，并通过多个成功案例带大家一探究竟。
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看清原子，SPA的划时代突破
20世纪以来，科学家们发展了冷冻电镜技术（cryo-EM），也即是利用透射电子显微镜（TEM）对迅速被冷冻在玻璃态冰的生物样品进行低温（一般为液氮温度-196℃）观察，并通过后期的图像处理获得目标样品结构信息的技术。这很好地应对了TEM观察生物样品的挑战，降低了电子束对样品的损伤，且实现了以近自然的状态观察样品的结构。但在相当长一段时间里分辨率较低，极大地限制了冷冻电镜在生物大分子领域的应用。
随着冷冻电镜软硬件的迅速发展，包括电子直接探测相机和数据处理软件的突破，使得冷冻电镜技术获得了突飞猛进的发展。单颗粒分析技术（SPA）——通过将生物大分子的溶液样品快速投入至冷却到液氮温度的液态乙烷中得到冰层厚度合适的冷冻样品，然后对冰层中均匀分布的生物大分子颗粒进行拍照得到成千上万张照片，然后通过算法对拍到的二维照片进行三维重构，最终得到其高分辨结构。发展至今，冷冻电镜单颗粒技术从分子量大的、高对称性的样品，向分子量更小、对称性更低甚至是没有对称性的样品方向发展，并且随着其软硬件的不断优化，已达到原子级别分辨率水平。2017年，诺贝尔化学奖授予Jacques Dubochet，Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家，以表彰他们对冷冻电镜的开创性贡献。
当SPA邂逅药物发现
冷冻电镜作为当前结构生物学研究的新兴技术，为基于结构的药物发现（SBDD）领域带来新机遇，可在药物靶点的设计和鉴定、苗头化合物的发现及先导化合物优化等环节中扮演重要角色。有别于传统X-ray晶体衍射（X-ray crystallography）技术，冷冻电镜在膜蛋白，如离子通道、G蛋白偶联受体（GPCR），蛋白复合物，分子胶等靶点的蛋白结构解析中发挥重要作用。
结构生物学研究有三驾马车，除了冷冻电镜外，还包括了X-ray晶体衍射和核磁共振（NMR），三者一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础。其中，X-ray晶体衍射最早诞生也最先得以广泛应用，目前依然是解析蛋白质结构的主要手段。如能够获得高质量的蛋白晶体，它获得的蛋白质结构分辨率较高。但蛋白结晶过程挑战重重。如果蛋白不易结晶或者晶体质量不佳，就无法得到高分辨率三维结构。而冷冻电镜SPA弥补了前者的不足，可在接近生理条件下直接获得复合体的结构，不需要蛋白质结晶，且需要的蛋白质用量更少，这使得针对难以结晶的膜蛋白或大分子复合物的研究取得更多成功。
（冷冻电镜单颗粒分析技术 VS X-ray晶体衍射）
SPA为新药研发提供了巨大机遇，在技术的演变浪潮中它又将走向何方？李博表示，纵观SPA历年来的迅猛发展，它势必将朝着通量更高、周期更短、分子量更小的方向迈进，最终落实到更多的科研应用场景中，让更多创新药研发企业有机会接触到这项革命性技术。
银河集团186net冷冻电镜平台—— 开启结构研究的无限可能与突破
目前，银河集团186net拥有两台高端冷冻电镜（Talos120，Glacios）及配套的仪器设备，如冷冻制样仪Vitrobot，辉光放电仪和多台图像处理工作站等。此外，银河集团186net目前在安装300 kV Krios的顶配冷冻电镜。基于先进的仪器设备和高水平的技术团队，银河集团186net研发人员能够独立完成单颗粒分析技术，实现基于结构的药物研发工作，囊落了从质粒构建、蛋白表达纯化、样品负染筛样、样品优化、冷冻筛样、数据收集、三维重构和蛋白原子结构构建的全方位服务。
银河集团186net在蛋白质表达领域拥有大量的研究基础和技术积累，从源头保证蛋白样品的稳定性和均一性，为冷冻电镜的高质量观测解析提供坚实的前期准备。得到高纯度蛋白溶液后，实验进入负染阶段，研发人员进行低分辨成像以快速地判断样品的均一性，再到冷冻筛样环节，这一阶段分辨率可以达到中高水平。获得二维照片之后还需要经历图像的预处理，目标样品颗粒的提取和筛选以及蛋白的三维重构，最终得到蛋白的3D模型。最后，李博列举多个实践案例进一步阐述了银河集团186net在多个场景的结构研究。
（蛋白复合物+CPD的结构案例）
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